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猪细小病毒感染

      猪细小病毒( Porcineparvovirus,PPV)是一类小DNA病毒,是引起猪繁殖障碍的主要病原之一,其危害主要表现为受感染的母猪,特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等。由于被感染妊娠母猪临床症状不明显,其他猪感染后无明显临床症状。因而该病是以引起胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身不显症状为特征的一种母猪繁殖障碍性传染病。同时猪场一旦出现感染,很难根除,严重地影响了养猪业的发展,因此世界各地的研究机构围绕猪细小病毒病进行了广泛的研究,目前,在病原学、诊断、防治以及分子生物学方面已取得了很大进展。该病几乎存在于所有猪场,常危害初产母猪和血清学阴性母猪。近年的研究发现,该病毒还与新出现的仔猪多系统衰竭综合征有关。

一、病原

      本病病原属细小病毒科( Parvoviridae)细小病毒属( Parvovirus)。外观呈圆形或六角形,直径约20~28nm,20面体等轴立体对称,衣壳由32个壳粒组成,在氯化艳中的浮密度为1.37~1.39g/mL。病毒基因组结构简单,为单股线状DNA,大小约5.0kb,成熟的病毒粒子仅含有负链DNA基因组,两端均含有发夹结构。基因组包括2个主要的开放阅读框(ORF),5’端的ORF编码3种非结构蛋白NS1、 NS2、NS3,主要起调节蛋白的作用,3’端的ORF编码3种结构蛋白VP1,VP2,VP3,其中VP3可能是VP2的水解产物,VP1蛋白是构成病毒粒子的主要结蛋白,在体外表达后,不仅具有良好的免疫原性,而且可自我装配成病毒样颗粒,将其接种动物后可诱导产生强烈的免疫应答反应。研究猪细小病毒的VP2蛋白特性对预防控制猪细小病毒病具有重要意义。非结构蛋白NS也具有抗原性,在病毒复制时,它能持续刺激机体产生抗体。当猪自然感染猪细小病毒时,其体内将产生抗NS的抗体,而使用灭活疫苗的猪则没有这种抗体。Madsen等根据这一特点,利用杆状病毒体外重组表达的NS建立了区分细小病毒野毒感染猪和灭活疫苗免疫猪的鉴别方法。

      本病毒在几乎所有猪的原代细胞(如猪肾、猪睾丸细胞等)和传代细胞系(如PK15、IBRS2、ST细胞等)上都能生长繁殖。受感染的细胞表现为变圆、固缩和裂解等病变,并可用免疫荧光技术查出胞浆中的病毒抗原,病毒可在细胞中产生核内包涵体,但包涵体通常散在分布。另外,不同毒株间存在培养温度依赖性差异,从而可以解释不同分离株在猪体内的复制能力和毒力差异的现象。

      血清型:猪细小病毒只有一个血清型,但大致有四种毒株类型,不同毒株的毒力强弱不同。第一类以NADL-2为代表,是细胞适应后的弱毒株,感染妊娠母猪后不能经胎盘感染胎儿,被用作弱毒疫苗株。NAM-2毒株感染细胞后产生的缺损颗粒可干扰或减缓NADL-2的复制,这种干扰作用使宿主建立起抵抗病毒的免疫反应有了足够的时间,从而阻止病毒血症的产生和继发胎盘感染。第二类是以NADL-8为代表的强毒株,感染血清阴性母猪后,引起病毒血症,并通过胎盘垂直感染使胎儿死亡。第三类是以Kresse株为代表的皮炎型强毒株,有报道称其毒力比NADL-8株还强。第四类为肠炎型毒株,主要引起肠道病变。

      本病毒能凝集豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、鹅、猫、猴和人0型红细胞。其中以豚鼠的红细胞最好。鸡的红细胞对本病毒的敏感性有很大的个体差异。病毒感染的细胞培养物对红细胞有轻度的吸附作用或没有。

      本病毒对外界理化因素有很强的抵抗力,对热具有强大抵抗力,56℃48h不影响其感染性和血凝活性,在70℃经2h处理后仍不失感染力,在80%经5min加热才可使病毒失去血凝活性和感染性。本病毒的pH值适应范围很宽,在pH3~9间稳定。弱酸性至中性的介质适宜其血凝性的保持。对乙醚、氯仿等脂溶剂有抵抗力;酸、甲醛蒸汽和紫外线需要相当长时间才能杀灭本病毒,但是在0.5%漂白粉或2%NaOH溶液5min可杀灭病毒。

      病毒在机体分布:猪细小病毒通常在猪的扁桃体、颌下淋巴结、肾脏、肝脏、脊髓和肠系膜淋巴结内增殖。猪感染后3~7d开始通过粪便排出病毒,以后呈不规则排毒。受感染猪的脏器、分泌物、排泄物及种公猪的精液中均含有病毒,猪感染后6~10d即可产生高滴度的抗体并能持续数年,用血凝抑制试验能检测出该抗体。

      据报道用IF镜检法研究跨胎盘感染的机制,以确定母猪经口鼻接种病毒后母猪和胎猪组织中感染细胞的病变进展程序。检查邻近母体-胚胎连接的组织,显示病毒存在于绒毛膜的内皮和间质细胞,怀孕期越长,这些组织变化越大,病毒抗原从不在子宫上皮或滋养外胚层中被检出。病毒通过巨噬细胞间的传递已经肯定不论哪种途径,母猪的病毒血症是跨胎盘感染的先决条件。

二、流行病学

      1.易感宿主    目前所知,猪是唯一的已知宿主,不同年龄、性别和品系的家猪、野猪都可感染,感染后终生带毒。在急性感染期,可以通过多种途径(如粪、尿和精液等)排毒。据王川庆等( 1995)报道,本病对长白、杜洛克、汉普夏、约克夏等几种品种猪的感染无明显差异,可见本病对品种的感染不受限制。另外,牛、绵羊、猫、豚鼠、小鼠、大鼠的血清中也可存在本病病原的特异性抗体。

      2.传染源    目前没有证据表明公猪的生育能力和性欲是否受猪细小病毒的感染而改变。感染本病的母猪是本病的主要传染源。本病感染的母猪所产的死胎、活胎、仔猪及子宫内分泌物均含有高滴度的病毒。垂直感染的仔猪至少可带毒9周以上。某些具有免疫耐受性的仔猪可能终身带毒和排毒。感染猪的排毒期虽然只有7~14d,但是被其污染的圈舍至少在4个月内仍具有感染性,急性感染期猪的分泌物和排泄物,其病毒的感染力可保持几个月,所以病猪污染过的猪舍,在空舍四个半月后仍可感染猪。这主要是因为病毒对外界理化因素具有很强的抵抗力而导致的。

      公猪在PPV扩散中起着重要的作用。被感染公猪的精细胞、精索、附睾、副性腺中都可带毒,在交配时很容易传染易感母猪。在病毒急性感染期,经精液等各种途径排出病毒。病毒也可从外部污染精液,如含有病毒的粪便或生殖道。将病毒注入包皮5天后,或口鼻注射后5~8d即可自睾丸分离到病毒。公猪经口鼻接种后,在5、8、15、21d和康复后5d扑杀,可在阴囊淋巴结发现病毒,在接种后第8d,取淋巴结小块与胎猪肾细胞共同培养,可见有病毒生长。不论免疫状况如何,公猪都能散布病毒,感染易感母猪。

      3.传播途径    该病主要通过消化道和呼吸道传播,公猪、母猪和育肥猪的感染大多数是由于接触污染的饲料和饮水造成的,另外也可以通过生殖道传播,还可经胎盘传播给胎儿,构成垂直传播导致病害,同时发现,一侧子宫角内的胎儿感染后,可以水平传播给另一侧子宫角内的胎儿。本病可经胎盘垂直感染和交配感染。另外,鼠类也可机械性的传播本病,出生前后的猪最常见的感染途径分别是胎盘和口鼻。

      4.流行特点    本病常见于初产母猪。刘金华、陈艳红、史为民( 1999)报告华北某猪场经产母猪暴发本病损失十分惨重。据报道本病的发生与季节关系密切,多发生在每年4~10月份或母猪产仔和交配后的一段时间。阴性猪场一旦引入带毒猪,通常全场猪在3个月内都会被感染,该病呈地方流行性或散发,并持续多年。病毒主要侵害新生仔猪、胚胎、胚猪。母猪早期怀孕感染时,其胚胎、胚猪死亡率可高达80%~100%。本病的感染率与动物年龄呈正相关,5~6月龄阳性率为8%~29%,11~16月龄阳性率可高达80%~100%,在阳性猪群中约有30%~50%的猪带毒,猪在感染细小病毒后3~7d开始经粪便排出病毒,1~6d左右产生病毒血症,以后不规则地进行排毒,污染环境。1周以后可测出血凝抑制抗体。2d内抗体滴定可达1:15000,且能持续数年。由于感染病毒的时期不同而表现有所不同。怀孕初期(30d以内)感染时,则因胎儿的死亡而吸收,使母猪不孕和无规律的反复发情;怀孕中期感染时,则胎儿死亡后,逐渐木乃伊化,在分娩时产程延长而造成死产等;在怀孕后期(70d以后)感染则大多数胎儿能存活,且外观正常,但可长期带毒、排毒。

      5.本病的发现与现状    细小病毒,是于1966年由Mary等在培养猪瘟病毒时首次发现的。1967年 Cartwright等在进行猪繁殖障碍病因学调查时,从临床病料中分离到了该病毒,并证实了其致病作用,其后欧、美、亚洲及大洋洲很多国家均有本病的报道。目前世界各地的猪群中,该病普遍存在,在大多数猪场呈地方性流行。国内潘雪珠( 1982)首次从上海分离到本病毒以来,东北、华北、华中、华南、西南地区都相继有本病发生的报道。年王东等( 1985)又报道从宁夏、西安、兰州、呼和浩特等地区亦发现了本病的存在,且阳性率很高(猪场阳性率100%,猪群阳性率82.21%)。由此可见,在我国,本病已广泛分布,所以一定要引起足够的重视,以免造成大的经济损失。

三、发病机理

      母猪多在怀孕前感染,其病毒主要分布于猪体内一些增生迅速的组织,如淋巴结生发中心、结肠固有层、肾间质、鼻甲骨膜等。目前发病机理还不完全清楚,但至少可以知道母体感染细小病毒并形成病毒血症是经过胎盘感染胎儿的先决条件,胎儿的死亡可能是由于病毒使很多组织和器官包括胎盘都受到损伤而引起的。病毒分布的显著特点之一是广泛存在于内皮细胞,这将阻止胎儿脉管网络的进一步发育。细胞有丝分裂的准备期,可促使病毒复制并导致细胞死亡。胎儿的循环系统的损伤主要表现为:水肿、出血和体腔中大量的浆液性渗出液的聚集以及镜下所见的内皮细胞坏死。有人曾人工接种猪细小病毒,用免疫荧光显微镜法鉴定母体和胎儿组织中的感染细胞,发现越到妊娠的后期,绒毛膜的间质细胞和内皮细胞内的病毒越多,而在子宫内皮细胞及滋养外胚层没有查到病毒抗原,因此,不能证明病毒是通过这些组织进行母体一胎儿传染的,但这种途径也不能完全排除,因为仅检查了母体和胎儿接触区的很少一部分。还认为病毒是通过巨噬细胞传播的。

      大量研究结果可以证实,如果在怀孕前70d任何时期被感染,都易导致母猪繁殖障碍。母猪在怀孕中期(70d)以后接触病毒时仍然可以发生跨胎盘感染,但胎猪在子宫内常常存活,没有明显的临床症状。可能的理由是跨胎盘感染需要10~14d或更久,怀孕期达70d时,多数胎猪对PPV能产生保护性免疫应答。

      母猪:病毒在感染母猪的组织器官内大量繁殖,并引起病毒血症,同时随血液循环到达胎盘感染胚胎或胎儿,使胚胎或胎儿生长受阻或死亡。母猪的生殖生理特点使母猪在妊娠早期对细小病毒易感,母猪在此期感染后,胎儿被吸收或木乃伊化,胚胎或胎儿死亡,此期胚胎死后迅速被吸收,因此母猪往往产仔少;进入妊娠中期的母猪感染猪细小病毒时,病毒穿过胎盘,但此期胎儿大都能产生保护性免疫应答,胎儿在子宫内生存完好,无明显临床表现,因此,通常在70d内官内接种猪细小病毒造成胎儿死亡,而妊娠后期(超过70d)感染细小病毒,胎儿不会死亡并且还能产生抗体。

      目前还未见有关猪细小病毒对排卵前母猪的卵细胞的影响的报道,但有研究表明病毒感染受精卵时紧紧地吸附在透明带外面,在胚胎形成后即进入胚胎进行大量复制,用荧光显微镜可观察到死亡胎儿组织细胞内含大量病毒。由于病毒损伤胎儿的组织器官及胎盘,从而导致胎儿死亡,此时胎儿循环系统损伤主要表现水肿、出血、体腔积聚大量浆液性渗出液。同窝胎儿部分经胎盘感染外,病毒在子宫内散播也是造成同窝胎儿感染的主要原因。但妊娠早期由于胚胎死后很快被吸收,不易出现病毒在子宫内散播。

      公猪:感染猪细小病毒的公猪精液可感染母猪,使妊娠母猪出现怀孕时的初始感染,成为感染其他猪的传染源。

四、临床症状

      易感猪的急性感染通常都表现为亚临床症状,但是大多数组织器官中存在大量病毒。感染后仅有的临床症状是发生繁殖障碍,而且临床上的表现还取决于病毒感染母猪的妊娠阶段,在母猪妊娠30d内感染,主要导致胎儿死亡、重吸收;在母猪妊娠30~50d内感染,主要表现为胎儿木乃伊化;妊娠50~60d内感染,主要发生流产、产死胎;母猪妊娠70d后感染,一般不引起病害,个别感染母猪产弱仔,这主要是由于怀孕中后期的胎儿的免疫系统逐步完善,感染后可以产生保护性免疫应答。病毒感染对种公猪的生产性能没有影响。

      猪细小病毒感染的主要症状表现为母源性繁殖障碍。感染的早期母猪可能重新发情而不分娩,或只产出少数仔猪,或产生死胎、弱仔或木乃伊胎等。当胎儿死亡,死胎连同其内的胎液均被吸收时,唯一可见的外表症状是母猪的腹围减少。当胎猪在怀孕中期或后期死亡时,羊水等液体又被吸收,外观显示的唯一症状是母猪的腹围缩小。发生繁殖障碍的母猪除出现流产、死产、产弱仔、木乃伊胎及不孕等现象外,大部分无其他明显临床症状,个别母猪有体温升高、后躯运动不灵活或瘫痪,关节肿大或体表有圆形肿胀等。在一窝仔猪中有木乃伊存在时,可使怀孕期和分娩间隔时间延长,这就易造成同窝外表正常的仔猪的死产。

      一般怀孕50~60d感染时多出现死产,怀孕70d感染的母猪则常出现流产症状,而怀孕70d以后感染的母猪则多能正常产仔,但这些仔猪常常有抗体并长期带毒。此外,本病还可引起仔瘦小、弱胎、母猪发情不正常、久配不孕等症状。实验感染的新生仔猪可出现呕吐、下痢等症状。

      在青年猪以及较大的种猪中,病毒在分裂旺盛的各种组织(尤其在淋巴组织)内广泛增殖。许多猪不论什么年龄和性别在接触病毒后lOd内都显示短暂的轻度白细胞减少。母猪繁殖障碍的其他表现还有返情、屡配不孕以及妊娠期、产仔间隔延长等。近几年的研究还发现,猪细小病毒感染与仔猪多系统衰竭综合征的发生存在相关性,常与猪圆环病毒发生混合感染。

五、病理变化

      怀孕母猪感染细小病毒后,一般无肉眼可见病变,仅在母猪流产时,肉眼可见母猪有轻度子宫内膜炎,胎盘部分钙化。特征性的病理变化在胎儿。

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      妊娠前期(1~70d)是猪细小病毒增殖的最佳时期,因为该病毒适于在增殖能力旺盛的,处于有丝分裂的细胞内繁殖,所以在此阶段一旦被猪细小病毒感染,则病毒集中在胎盘和胎儿中增殖,故胎儿出现弱仔、死亡、木乃伊化(图2.2.10-1、2)、骨质溶解、腐败、黑化(图2.2.10-3)等病理变化,母猪流产。大多数死胎、死仔或弱仔皮肤、皮下充血或水肿,胸、腹腔积有淡红或淡黄色渗出液(图2.2.10-9),肝、脾、肾有时肿大脆弱或萎缩发暗。个别死胎、死仔皮肤出血。弱仔初生重低于正常仔猪,活力弱(图2.2.10-10),生后半小时先在耳尖,后在颈、胸、腹部及四肢上端内侧出现淤血、出血斑,半天内皮肤全变紫而死亡。这种情况多见于产前2个月左右曾流行过猪瘟的猪场。除上述各种变化外,还见到畸形胎儿,干尸化胎儿(木乃伊)及骨质不全的腐败胎儿。

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      病理组织学变化表现为妊娠母猪黄体萎缩、子宫黏膜上皮和固有层有局灶性或弥漫性单核细胞浸润。死胎或死产的仔猪取脑作组织学检查,可见非化脓性脑炎变化,血管外膜细胞增生,浆细胞浸润,在血管周围形成细胞性“管套”,主要见于大脑灰质、白质、脑软膜、脊髓和脉络丛。肺、肝、肾等的血管周围也可见炎性细胞浸润。还可见间质性肝炎、肾炎和伴有钙化的胎盘炎。

      死于急性猪细小病毒感染的新生动物,心肌弥漫性变性。由于病毒在长骨、肋骨及肋软骨的接合处生长,导致骨质退化。病毒对颅骨和下颌骨膜有明显的亲合性。病毒的复制干扰了这些骨的生长,导致头骨畸形。病毒在肠,特别是小肠腺窝上皮复制引起肠炎。病毒侵袭肝脏可引起肝炎。在上述组织中都可以找到特殊的细胞核内包涵体。

      感染母猪不见明显的肉眼病变,受感染的胎儿则表现不同程度的发育障碍和生长不良,或出现木乃伊胎儿、畸形胎儿、骨质溶解腐败的黑化胎儿等。

六、诊断

      猪细小病毒感染可以依据临床症状和流行病学做出初步诊断,如果发生流产、产死胎、异常胎儿而没有其他别的什么临诊症状。同时有其他证据可判定是一种传染病时,应考虑到细小病毒感染的可能性。但是进一步确诊必须进行实验室诊断。但大于70日龄的木乃伊胎儿、死产仔猪和初生仔猪则不宜送检,因为其中含有相应的抗体而干扰检验。常用的实验室检测方法有病毒分离鉴定、血凝及血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验、荧光抗体试验、乳胶凝集试验等,到核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)等,但是各种诊断方法各有利弊,其中血凝及血凝抑制试验已经得到了国内外学者的普遍认可,在临床检测中被广泛应用。     

(一)病毒分离鉴定

      病毒分离鉴定是直接检测病原,常需要配合免疫荧光技术,其用于诊断的最大优点是结果准确可靠,可以作为最后确诊,病毒分离应采集流产胎儿或死胎的肾、睾丸、肝、肺、肠系膜淋巴结或母猪胎盘、阴道分泌物(其中以肝及肠系膜淋巴结分离率最高),制成悬液,研磨制成1:5~1:10的乳剂,加双抗处理,接种到原代仔猪肾细胞或猪传代细胞单层上,培养16~36h后观察细胞核内包涵体,5~10d后观察特征性CPE(即细胞中出现弥散性颗粒,细胞变圆、丛集、固缩、崩解直至脱落),收毒后用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验或中和试验进行诊断鉴定。虽然此方法是最准确的诊断方法,但是费时费力,并且需要一定的技术条件和设备,另外,其检测结果常受到胎儿死亡时间的影响。     

(二)血清学诊断

      1.血凝抑制(HI)试验    在猪细小病毒的血清学诊断方法中,血凝抑制(HI)试验是检测猪细小病毒抗体最常用的经典方法,一般采用试管法或微量法。利用HI试验检测人工感染PPV的猪;发现感染后5d即可检测到相应抗体,12~14d抗体滴度高达1024~4096,并能持续多年检出抗体。该方法简单、方便,灵敏度也较高。进行HI试验时待检血清需要首先进行热灭活处理,然后再用红细胞吸附,以除去血清中的非特异性血凝素,进一步用高岭土吸附以除去或减少血清中非特异性抑制因子。目前,该方法在国内外已得到广泛应用。

      2.血清中和试验血清中和试验(SN)也是检测PPV抗体的方法之一,其原理是利用被检血清的抗体中和PPV,然后根据培养细胞的病变情况来计算血清抗体的滴度。SN的特异性比HI高,但是SN的操作较为复杂,首先要进行病毒感染力的测定,而PPV在低剂量时并不引起细胞病变,从而限制了该方法的使用。

      3.乳胶凝集试验    乳胶凝集试验(LAT)是将浓缩的猪细小病毒悬液制成乳胶凝集抗原,与待检血清在玻璃平板上作用,观察是否出现肉眼可见的特异性凝集颗粒从而进行判定的方法。此法简便、快速、准确,可用作临床上大量血清样本的初筛。

      4.酶联免疫吸附试验    酶联免疫吸附试验(ELISA)是将酶与抗体偶联并使之参与到抗原抗体反应中,依据酶催化底物所发生的变色反应程度,来指示和量化抗原抗体反应水平,从而进行抗原或抗体的检测。这种方法灵敏度高、特异性好、快速、操作简便,可用于对大规模样品的检测。 ELISA是WestenbrinkF等(1989)建立的,并证明了 ELISA方法与HI检测结果的一致。后来ShiraishiT又发明了用滤纸采取血样,用ELISA法进行猪细小病毒检测,即Dot-ELISA,使采样更方便易行。张晓根等( 1994)建立了间接Dot-ELISA对猪细小病毒抗体的最低检出率提高到了2.5ng/点。付利芝等(2001)建立了间接斑点辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白免疫实验(间接Dot-PPA-ELISA)检测猪细小病毒抗体的方法。结果表明间接Dot-PPA-ELISA的特异性强、方法稳定。姜永厚等( 1997)建立了从胎猪脏器中检测猪细小病毒抗原的ELISA双抗体夹心法。    

(三)免疫学诊断

      1.免疫荧光显微检测     免疫荧光显微检测法检查病毒抗原可靠、非特异性少、敏感,采集一些死产或木乃伊化胎儿的肺、肾、肝、肠、脑、睾丸、淋巴结及胎盘等(母猪子宫内残存的胎儿组织或木乃伊胎儿的肺是很好的免疫荧光显微镜检查材料),制备冰冻切片,进行荧光抗体染色,在荧光显微镜下观察细胞内着染荧光的病毒抗原集结从而进行确诊。

      2.免疫电泳    Sorensen K.J等建立了对流免疫电泳检测法。在一定的pH、离子浓度和电流强度下,在琼脂凝胶或琼脂糖凝胶中电泳,观察结果。王庆川等利用此法进行了PPV抗原、抗体的检测,证实该法有较强的特异性和可重复性。此法简便、快速、省力、不需对抗原和血清进行处理。    

(四)聚合酶链式反应( PCR)

      聚合酶链式反应(核酸探针技术)是20世纪80年代建立起来的一项体外酶促扩增新技术,可用于对疑似感染猪细小病毒的临床样品或哺乳动物细胞培养物的检测,这种方法敏感、特异、准确。目前,这一方法被广泛应用并建立了一系列检测方法。

      1985年,美国PE-Cetus公司人类遗传研究室 Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应,使人们梦寐以求的体外大量扩增核酸片段的愿望成为现实,之后该技术渗透于生物学科的每一个分支。其用于猪细小病毒病的诊断大大提高了诊断的敏感性和特异性,尤其对实验室检测细胞系的污染更为实用和重要。该方法在今后将会得到更广泛的应用,不过,由于PCR技术需要PCR仪等设备,使得该方法在临床上的应用受到了一定的限制。华中农业大学赵俊龙等根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了1对寡核苷酸引物,成功地从猪细小病毒感染的组织和细胞中扩增出445bp片段,建立了用于猪细小病毒感染检测的PCR方法,该方法可以检测出10~4个TCID50的病毒含量。利用该方法对临床上24份流产病料进行检测,查出阳性16份,而同时利用血凝抑制试验检测只有10份阳性。结果表明该试验建立的PCR诊断方法灵敏度更高、特异性更强。

      王汉中等根据猪细小病毒基因组的vp2基因,设计了两对引物进行套式聚合酶链式反应( Nested-PCR)体外扩增,产物经2%琼脂糖凝胶电泳和生物素标记的探针鉴定,证实具有特异性。敏感性实验证明,套式PCR能检测到1TCID50的病毒量,在临床上应用本方法能从不同的组织样品和粪便中检测出猪细小病毒,具有很高的敏感性。

      用于PPV感染的诊断方法很多,各种方法具有不同的优缺点,相对而言,目前应用较多的是HA和 HI试验,这两种方法基本能满足常规的病原检测和血清流行病学调查等需要。要得到病原学的确诊,则最好利用病毒分离鉴定方法,这时免疫荧光技术经常成为首选。其他血清学诊断方法则根据不同的实验室条件和情况选择应用。不言而喻,核酸探针和PCR诊断技术的应用将会越来越广,这两项技术尤其是PCR技术是所有诊断技术中灵敏度最高的诊断方法。

      本病的诊断应与日本乙型脑炎、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸障碍综合征、迟发性猪瘟、衣原体感染、猪布鲁菌病等疾病进行鉴别区分。

七、免疫学

      免疫学最大特点是猪细小病毒血清型单一并具有高免疫原性,本病最多见于初产母猪,母猪首次感染后可获得坚强的免疫力,甚至可终生获得免疫。疫苗接种成为控制本病的一种行之有效的方法。在配种前进行疫苗接种,可在怀孕的整个敏感期产生免疫力。实验表明,在怀孕70d以前经子宫内接种PPV,胎猪通常死亡,但在怀孕后期接种时胎猪通常存活并产生抗体。猪细小病毒可在肺泡巨噬细胞和淋巴细胞内复制,并损害巨噬细胞的吞噬功能和淋巴细胞的母细胞化能力(Harding和Molitor,1988),引起免疫抑制。

八、防制
(一)预防原则

      以本病病原生物学特性、临床流行病学特点以及免疫机制特性的理论为基础制定预防策略,实践证实是行之有效的。在引进种猪时无本病的各猪场应进行猪细小病毒的血凝抑制试验检测。当HI滴度在1:256以下或阴性时,方准许引进。在配种前一个月接种灭活疫苗,种公猪每半年接种疫苗一次。疫苗接种对象主要是初产母猪和第二胎经产母猪,第三胎以上的经产母猪通常有较高的抗体水平,所以不必再接种疫苗。     

(二)免疫预防

      目前,应用的疫苗有猪细小病毒灭活疫苗和弱毒疫苗,其中灭活疫苗已在国内外广泛应用。在早期的研究报告中,猪细小病毒疫苗的免疫均为间隔2~3周的二次注射接种,随着疫苗生产工艺的改进,许多学者发现一次免疫注射也能达到良好的效果。Paul(1987)等报道,母源抗体对疫苗接种后产生主动免疫应答有干扰作用,而猪细小病毒母源抗体可持续20~24周,因此疫苗的接种时间应选择在20周龄左右,即大约在母猪配种前1个月进行免疫接种。在疫苗免疫接种后要进行抗体监测,以便评价疫苗免疫的效果。预防该病还需要加强管理,对于阴性猪场要避免引入阳性猪只,在引种时进行血清学或病原学检查;对于阳性猪场要合理管理阳性猪,初产母猪在配种前可以进行人工主动免疫接种。猪场无该病感染,最好不免疫,必须免疫时,最好使用灭活苗。

      疫苗种类:目前应用的疫苗有猪细小病毒灭活疫苗和弱毒疫苗。美国1980年已研制成一种灭活苗和一种弱毒疫苗。灭活苗的免疫期可达4个月以上。通过猪睾丸(ST)细胞120~165代致弱的猪细小病毒毒株,经胎猪肾( PFK)细胞培养制成弱毒苗,肌注后可预防初产母猪的细小病毒感染。但当直接接种子宫内时对胎儿有致病性,因此这种疫苗只适用于未怀孕的初产母猪。李火林等(1994)使用猪细小病毒油佐剂灭活苗对后备母猪免疫后的效果表明,免疫组比不免疫组头胎产活仔率提高6.5%,对隐性流产也有所控制。

      目前,我国也已研制出灭活疫苗。在母猪配种前2个月左右注射可预防本病发生,仔猪母源抗体的持续期可达14~24周,在抗体效价大于1:80时可抵抗猪细小病毒的感染。因此在断奶时,将仔猪移到无病污染的地方饲养,可培育出血清阴性猪群。中牧股份成都厂生产的猪细小病毒活疫苗系选育国外猪细小病毒弱毒株,经细胞培养,收获细胞病毒感染液制成,于母猪、公猪配种前2周进行肌肉注射免疫。灭活疫苗则采用猪细小病毒经MRS细胞培养,收获感染病毒液,经灭活后加入佐剂乳化后制成,于母猪、公猪配种前3~4周颈部肌肉免疫注射。

      免疫程序:疫苗接种对象主要是初产母猪、经产母猪和公猪。接种前应进行血清抗体检测,血清学检查为阴性时才进行免疫接种。在疫区,对初产母猪在配种前2个月用灭活苗和弱毒苗接种,配种前2~4周再次加强免疫,使初产母猪在怀孕前获得主动免疫,以保护胎儿免受感染。在配种前一个月接种灭活疫苗,种公猪每半年接种疫苗一次。初产母猪和第二胎经产母猪疫苗接种,第三胎以上的经产母猪通常有较高的抗体水平,所以不必再接种疫苗。

      Edwards等认为PPV疫苗只能用于没有母源抗体的猪。因为在田间条件下母源抗体可能在不同程度上千扰疫苗的效果。吕建强等进行了PPV母源抗体对灭活疫苗免疫效果影响的研究,结果证实不论母源抗体水平高低均不会明显抑制疫苗的主动免疫反应,但是具有低效价母源抗体猪的主动免疫抗体反应规律,与具有高效价母源抗体猪的主动免疫抗体反应规律不同。在母源抗体滴度大于l:149.5时,灭活疫苗接种后抗体水平先降低然后上升,升幅只有1~3倍;而母源抗体滴度小于1:25.6时,主动免疫抗体水平持续上升,母源抗体阴性的猪抗体水平增幅最大。根据PPV的流行病学特点,仔猪吃奶后2~3d即可在血液中检测到母源抗体,并于8~14d达到高峰,母源抗体可持续20~24周,因此PPV疫苗的免疫接种时间应选择在20周左右。

      展望:尽管猪细小病毒弱毒苗和灭活苗在本病的预防控制中起到十分重要的作用,但是各种疫苗均有不同程度的不足,寻找和研制更为有效的疫苗一直是猪细小病毒病免疫预防研究的主题,现代分子生物学的迅猛发展给新型猪细小病毒疫苗的研制开发提供了良好的平台,国内外已在基因工程亚单位疫苗及多价亚单位疫苗、基因疫苗方面进行了较多的研究和探索,并有望在转基因植物可饲(食)疫苗方面进行一些探索。     

(三)净化与根除

      在母猪配种前2个月左右注射可预防本病发生,仔猪母源抗体的持续期可达14~24周,在抗体效价大于1:80时可抵抗猪细小病毒的感染。因此在断奶时,将仔猪移到无病污染的地方饲养,可培育出血清阴性猪群,这有利于本病常发区猪场的净化。目前公认使用疫苗是控制本病的有效方法。根据猪场情况,选用合适的疫苗,减少本病带来的损失,提高经济效益。

      目前,对该病还没有有效的治疗方法,同其他许多病毒病的防制一样,免疫预防是控制该病的关键,由于猪细小病毒血清型单一及其高免疫原性,使得疫苗接种成为控制猪细小病毒感染的有效措施。初产母猪在其配种前可通过人工免疫接种获得主动免疫。另外,要妥善处理感染猪的排泄物、分泌物及污染的器具、场所和环境等。由于该病毒对外界理化因素有很强的抵抗力,进行消毒时要采用其敏感的消毒剂,如0.5%漂白粉或2%氢氧化钠。

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