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猪轮状病毒病

      轮状病毒病( Swine rotavirus disease)是轮状病毒引起的仔猪、犊牛、羔羊、驹、幼兔、鹿、猴、犬、家禽及新生婴儿的急性胃肠炎,特征为急性腹泻。

      本病最早( 1943)在患腹泻的儿童中发现,以后在多种动物的腹泻便中分离到病毒。1974年由 FLEWE等首次提出轮状病毒这个名称,并为1976年的国际病毒命名委员会所采用。本病分布很广,几乎五大洲均有报道,我国已从多种动物和人的粪便中分离到轮状病毒。本病能侵害人类和许多种畜禽,不仅感染率高,有时发病率也相当高,对人类健康和畜牧业的发展都有较大的危害,因此逐渐为人们所关注。

一、病原

      轮状病毒( Rotavirus)属呼肠孤病毒科轮状病毒属。由11个双股RNA片段组成,有双层衣壳。病毒粒子直径为65~75nm的20面体,经氯化铯梯度离心法测定,密度为1.36mg/mL,有32个壳粒,沉降系数为525S,核酸有117个节段,有8~10种多肽,哺乳动物宿主,无媒介体,水平传播。

     电子显微镜观察,可见到3种形态的病毒粒子:①双层衣壳的病毒粒子,有外层衣壳、内层衣壳和20面体髓核,直径约70nm;②单层衣壳的病毒粒子,直径约60nm,没有外层衣壳;③髓核,直径约52nm,含有病毒基因组和依赖于RNA的RNA聚合酶。只有双层衣壳的病毒粒子具有感染性。

      毒粒结构:据报道(Bridger和Woode,1976, Bican等,1982),双壳病毒粒子、单壳病毒粒子和核心等3种形式的病毒粒子在氯化艳中的浮密度分别为1.36g/cm3、1.38 g/cm3和1.44 g/cm3

      基因组:为含11个节段的双链RNA,约有18522个碱基对(Cohen,1989)。聚丙烯酰胺凝胶电泳时,基因组11个RNA节段群集在4个区域,产生特征性的电泳移行图,称之为电泳型,被用于轮状病毒的分群。电泳型和血清群之间存在着相互关系,但血清学比核酸鉴定的可靠性更强。基因组的每一节段编码一种蛋白,共包括6种结构蛋白(VPl-4, VP6.7)与5种非结构蛋白(NSP1-5)。

      病毒基因组实际上由三层衣壳蛋白同心包裹。最外层衣壳由非糖基化蛋白VP4( 88kD)的二聚体与糖蛋白VP7的三聚体组成,构成60个纤突;VP4与VP7均为病毒的中和抗原,VP4由第4基因片段编码,与病毒入侵、宿主嗜性、感染性、毒力、血凝性及免疫保护力有关。病毒感染细胞时,VP4必须被蛋白酶水解成VP5和VP8才能完成病毒对细胞的吸附与穿透。VP7由第8或第9基因片段编码,与病毒的感染性及免疫保护力有关。

      中间层(内衣壳)由VP6 (41kD)的三聚体组成,VP6蛋白含有多数的群抗原和亚群抗原;最内层为T=1对称,由60个VP2( 94 kD)的三聚体组成, VP2上有少数亚群特定抗原表位。VP2包裹着基因组 RNA及两个次要蛋白VP2与VP3,共同组成病毒的核心。VP2具有非特异性RNA结合活性,其氨基端是 VP1(125kD.RNA依赖的RNA聚合酶)与VP3(88 kD,guanylytransferase methylase)进入病毒粒子核心所必需的结构。VP2- VPl-VP3组成病毒增殖复合体,与NSP2,NSP5等非结构蛋白一起参与基因组复制、组装核心及衣壳等功能。

      抗原和型:轮状病毒有两种抗原,一种为群特异性抗原,存在于内层衣壳,为各种动物轮状病毒所共有,属共同抗原;另一种为型特异性抗原,存在于外层衣壳,也与一定的RNA基因组片段有关。不同群间无任何血清学交叉反应,同群不同型间有部分交叉中和反应。从不同种动物分离的病毒,不出现明显的交叉中和反应,可用中和试验和ELISA阻断试验加以区别。

      病毒抗原:轮状病毒粒子表面有3种抗原,群抗原、中和抗原与血凝素抗原。群抗原主要与基因组第6节段编码的内衣壳蛋白VP6有关。中和抗原主要有VP4与VP7两种结构蛋白。血凝素抗原为VP4。但只有某些毒株具有血凝素,可凝集人0型、豚鼠和大鼠红细胞。

      依据VP4与VP7的差异将轮状病毒分为两型, VP4型称为P型(Protease-sensitive protein,蛋白酶一敏感蛋白),VP7型称为G型(Glyeoprotein,糖蛋白)。因此可用群/株/亚群/G型/P型对某轮状病毒进行界定。

      迄今为止,猪A群轮状病毒至少已检测出11个G型与4个P型。可利用单克隆抗体、核酸探针、反转录一聚合酶链反应( RT-PCR)法对猪轮状病毒进行 G、P型的分型,但在P型的确定结果有分歧。用核酸法鉴定出4个P型猪轮状病毒,其中只有两型可用血清学方法进行准确界定。据报道C群猪轮状病毒有两个或更多的血清型。

      细胞培养:  猪轮状病毒很难在细胞培养物上生长。A群的某些毒株、B群与E群迄今尚未能适应细胞。猪A群轮状病毒的许多毒株经胰蛋白酶(10μg/mL)预处理30min后可适应猪原代肾细胞与旋转培养的非洲猴肾细胞系MA-104。另外,也可在病毒吸附后用含胰蛋白酶(0.5~l.0μg/mL)的无血清维持液增殖病毒。

      适应细胞培养的轮状病毒株能产生细胞病变,并形成空斑。细胞病变表现为细胞固缩,随后从细胞单层脱落。

      猪C群轮状病毒也可在旋转培养的猪原代肾细胞及高浓度胰酶维持液中增殖,并可适应MA-104细胞系。

      病毒侵入细胞是一个多步骤过程。A群轮状病毒的细胞受体是单唾液酰神经节苷酯( Mono sialo- ganglioside)或其家族成员。VP4与病毒对细胞的吸附、穿透及在细胞中的定位有关。胰酶的作用是将 VP4特异性裂解为VP5与VP8两个亚单位。VP8首先与含唾液酸的细胞受体结合,然后VP5与细胞整合素a2β1结合,此后,VP5与整合素avβ3及热休克蛋白Hsp70结合以完成病毒人侵的后吸附过程。

      国际病毒分类委员会(ICTV)第6次报告( 1995)将轮状病毒分为6个群,即A,B,C,D, E,F。目前已报道了7个抗原性存在差异的轮状病毒血清群(A~G)。是根据群抗原及病毒RNA末端指纹图的差异将轮状病毒分为A~G7个群。A群为典型轮状病毒,同胃肠炎关系最密切;B群为非典型轮状病毒,或叫类轮状病毒,C群轮状病毒也称副轮状病毒。A,B,C,E四群均可感染猪,但E群只在英国猪群中有报道。A群为常见的典型病毒,宿主包括各种动物和人,而其他几个群则较为少见。各血清群轮状病毒均有独特的电泳型,A群轮状病毒电泳型呈4:2:3:2排列模式,B群为4:2:2:3, C群为4:3:2:2,D群为5:2:2:2,E群和B群相似。A群病毒在感染的细胞中既能合成结构蛋白(如VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7),也能合成非结构蛋白(NS1~4),病毒的外层衣壳由VP7及 VP4双层组成,外层及中层衣壳由VP6组成,芯髓由 VP1、VP2及VP3组成。B群宿主为猪、牛、大鼠和人,C群和E群为猪,D群为鸡和火鸡,F群为禽。据报道,轮状病毒在细胞上连续传代,基因图谱会发生演变。又根据dsRNA距离不同,分长型和短型两大类。在哺乳动物中,以A群,B群和C群检出较为普遍。A群又分两个亚群,电泳型短型为I亚群,电泳型长型为Ⅱ群。动物轮状病毒到目前为止所见到的均为长型。然而其抗原却属于I亚群,只有极为少数的毒株属于Ⅱ亚群。

      培养特性:轮状病毒的分离和体外培养一般比较困难,仅有极少数毒株能在体外细胞中培养生长,多数病毒粒子(约90%)缺乏感染性,用胰酶对样品提前处理,以及在细胞培养的营养液中添加胰酶有利于病毒的分离培养,可使其感染性增强。粪样经胰蛋白酶(10~ 20μg/mL)处理后接种细胞,一般可在传3~5代后出现细胞病变,可提高猪、牛粪便中轮状病毒的分离率。

      不同动物种别的轮状病毒,可采用相应种别的原代肾细胞或有关传代细胞系进行培养,新生犊牛腹泻轮状病毒可使罗猴胚肾细胞( MA~104)系产生明显的空斑,也可用牛肾细胞传代,但引起病变不易辨认,需借助荧光抗体技术确认病毒的存在。羊轮状病毒也可用牛肾细胞培养。猪轮状病毒细胞培养更加困难,某些毒株只有在培养液中加入0.5~2pg/mL胰蛋白酶,培养24h后通过荧光抗体技术检查才能确认获得成功。常用猪肾原代细胞。犊牛、马驹、仔猪、小鼠和婴儿的轮状病毒均具有共同抗原,可出现交叉反应,这种抗原性来自内衣壳。

      抵抗力:轮状病毒对理化因素抵抗力较强,本病毒比较稳定,在4℃下能保持形态的完整,加热至56℃经lh不能灭活,对乙醚、氯仿、去氧乙酸钠有抵抗力,在lmol/L硫酸镁中加热56℃表现稳定,而在lmol/L氯化镁中同样加热不稳定。在pH3~10的环境中不能失去传染性。在粪便中,可耐受60℃30min,而18~20℃时至少可耐受7~9个月(Woode,1986)。在干燥的粪便、灰尘、产区污水和断奶舍都可检出轮状病毒,病毒在已清空的猪舍内可存活3个月。细胞培养适应病毒对热的耐受力有较大差异。在没有抗体的牛奶中,室温18~20℃放置7个月仍有感染性。本病毒需要胰蛋白酶来活化其感染性,这具有重要的生物学意义,能说明在动物体内感染的一些动态。在猪体内轮状病毒的感染主要限于小肠上皮细胞,仔猪小肠下2/3处胰蛋白酶浓度最高,说明轮状病毒在此感染最严重。1%福尔马林、0.01%碘酊、1%次氯酸钠和70%酒精可杀灭病毒。

二、流行病学

      1.易感性    7~41日龄仔猪易感,并出现严重临诊症状。1~3周龄仔猪的感染率高于4~6周龄仔猪。初产母猪的仔猪比经产母猪的仔猪更易感。7日龄以前仔猪可能受母源抗体保护而不常感染。成年猪多呈隐性感染。此外,悉生猪被用作研究人轮状病毒感染的实验动物。此外本病的易感宿主还有犊牛、羔羊、狗、幼兔、幼鹿、猴、小鼠、鸡、火鸡、鸭、珍珠鸡和鸽以及儿童。其中以犊牛、仔猪及儿童的轮状病毒病最为常见。轮状病毒有一定的交互感染作用,人的轮状病毒能感染猴、仔猪和羔羊,并引起发病;犊牛和鹿的轮状病毒能感染仔猪。由此可见,轮状病毒可以从人或一种动物传给另一种动物,只要病毒在人或一种动物中持续存在,就有可能造成本病在自然界中长期传播。特别是人轮状病毒,在人群中普遍存在,容易在牛、猪、羊等哺乳动物中传播。轮状病毒能感染不同年龄的人和动物,成人和成年动物一般为隐性感染,儿童和幼龄动物的发病率很高。

      2.传染源    患病的人、畜及隐性感染的带毒猪,都是重要的传染源。病毒经粪-口途径在猪群中传播。由于病毒稳定性强,不清洁的环境因素对病毒在畜舍中的存留起重要作用。

      血清抗体检测表明,猪轮状病毒感染相当普遍,成年猪血清抗体检出率达40%~100%,主要为猪A群、B群、C群。E群轮状病毒的抗体检出率在英国猪群中很高。而且畜群一旦感染,以后将每年发生,难以净化。这可能与病毒具有较强的抗逆能力有关。猪轮状病毒的复发性感染常出现间歇性的排毒现象。不同血清群或血清型都有可能产生这种感染。成年动物一般不排毒,然而有时在临近分娩期排毒,成为易感小猪的传染源。

      3.传播途径    病毒存在于肠道,随粪便排出外界,经消化道途径传染易感的人、畜和禽。痊愈动物从粪便中排毒的持续时间尚不清楚。污染的环境对猪群中轮状病毒的持续存在有着重要的作用。猪轮状病毒在极端环境条件下是很稳定的,它对常用消毒药的抵抗力很强,在干粪、尘埃、分娩和断乳猪舍的污水中都能检出,在空关3个月的猪舍中仍能存活。

      4.流行特点    轮状病毒感染通常以突然发生和迅速传播的方式在动物群中广泛流行,常呈地方流行性。动物和人的轮状病毒感染在流行病学上的特征基本相似。具有明显的季节性,多发生于晚冬至早春的寒冷季节。少数地区季节性不明显而呈终年流行。只要本病在一种动物群中长期传播,各种年龄的动物对轮状病毒均有易感性,感染率可高达90%~100%,但病死率低。以新生和幼龄动物发病为主,成年动物常呈隐性经过。卫生条件不良,致病性大肠杆菌和冠状病毒、慢病毒等混合感染,可使病情加剧,病死率增高。

      5.本病的发现与现状    本病呈世界性流行,是引起猪胃肠炎的常见病因。据报道,1~4周龄仔猪群的发病率超过80%,死亡率为70%~20%。我国自1982年首次报道猪轮状病引起毒腹泻以来,我国学者对华东地区的猪进行了轮状病毒感染流行病学调查,结果证实,6周龄猪血清抗体阳性率高达72%~83.8%。

      Z.F.Fu等从产仔猪舍、断乳猪舍和3个月内未饲养这类猪的猪舍采集的尘埃、粪便和污水样品中检出了轮状病毒,并证明了轮状病毒在猪与猪、窝与窝和猪舍之间的连续传播,对维持猪场的轮状病毒感染链发挥着作用。

      自然感染轮状病毒性导致腹泻,常发生于7~14日龄的哺乳仔猪或断奶后7d内的仔猪。仔猪发病日龄在特定猪群中往往较为一致。症状与人工发病相似,腹泻是本病的主要症状。粪便呈黄白、黄绿或暗黑色,水样或糊样,严重者带有戮液和血液。腹泻3~4d后,部分病例出现严重脱水并死亡。

三、临床症状

      非免疫的初生猪或未食初乳的新生仔猪喂以流体饲料并接种猪轮状病毒可复制本病。1~5日龄仔猪发病最严重,潜伏期12~24h,病初出现精神不振,食欲不良,偶尔发生呕吐。随后发生严重水泻并持续3~5d,粪便呈黄色到白色,带有数量不等的絮状物,之后经7~14d逐渐恢复正常。病猪发生严重脱水并可能在腹泻暴发2~5d后死亡,死亡率可达50%~100%。7~21日龄接种猪,腹泻和脱水不太严重,28日龄时接种猪仅发生1~1.5d的短暂腹泻。死亡率随接种年龄的增大而降低。

      自然发病的仔猪和实验感染的初生仔猪或未吃初乳的仔猪出现的临床症状相似。在感染后12~24h内,一般表现精神沉郁、食欲不振和不愿活动,以后发生严重腹泻,一般在腹泻后3~7d发生死亡,一般说来,普通饲养的小猪,在出生几天之内受到感染,如果断奶或母猪奶中缺少特异性轮状病毒抗体,会出现高死亡率。当用病毒给0~5日龄的初生小猪或未吃初乳的仔猪接种时,这种情况也会发生,那时死亡率可达100%。通常10~21日龄吃乳的小猪接种时,临床症状是温和的,腹泻1~2d后迅速康复,残废率低,无论断奶时是在2日龄还是在3~8周龄,轮状病毒所致腹泻的严重性,总是随断奶而增强,此时,死亡率一般是3%~10%,也可以达到50%,腹泻物的颜色和稠度可从黄、白(图1.6-2)到黑色,可以是水泻、半固体状和发酵状,或是在类似乳清的液体上漂浮着絮状物。排泄物的外观程度取决于所吃的食物,吃奶产生黄色腹泻,而吃固体食物一般是黑色或灰色腹泻,虽然一般说来,越是水泻,脱水越严重,但也并非如此,特别是断奶后的仔猪发生腹泻。

      哺乳仔猪自然感染轮状病毒往往只出现较轻微的临床症状,这可能与母源抗体保护有关。断奶仔猪腹泻综合征危害严重,所致死亡率可达10%~50%。虽然轮状病毒感染被认为是主要病因,传染性胃肠炎病毒(TGEV)或溶血性肠毒素型大肠杆菌也常常并发感染。人工接种试验发现,单独接种轮状病毒或溶血性大肠杆菌,只引起断奶仔猪短暂的轻度腹泻甚至呈亚临床表现,但如果先接种轮状病毒再接种溶血性大肠杆菌,则可发生类似自然病例的持续性严重腹泻。

四、发病机理

      轮状病毒的致病机理尚不十分清楚,已有的大部分资料集中在A群轮状病毒,对B、C、E群轮状病毒的研究较少。绒毛萎缩及小肠上皮细胞的损伤导致消化吸收障碍、体液平衡紊乱,局部绒毛缺血导致血管损伤,及NSP4的肠毒素作用等都与病毒的致病作用有关。轮状病毒主要在小肠绒毛上皮细胞的细胞浆内增殖,较少在覆盖肠集合淋巴结的M细胞和盲肠或结肠上皮细胞的细胞浆内增殖。轮状病毒增殖的结果导致小肠绒毛上皮细胞的机能发生障碍,感染细胞溶解和脱落。绒毛萎缩的程度和萎缩绒毛的分布与猪的年龄很有关系,这是决定症状严重程度的主要因素。总的讲,幼小猪绒毛萎缩更为严重和广泛。

      病毒主要侵害分化成熟的小肠绒毛上皮细胞,并在胞浆中进行复制,抑制上皮细胞的吸收功能。病毒主要感染动物的空肠及回肠绒毛顶端1/2~1/3的吸收细胞,导致细胞变性,坏死脱落,绒毛萎缩,因吸收功能降低导致腹泻。年龄较小的仔猪绒毛萎缩严重,症状也最严重。此外,在脱落上皮处的腺管上皮细胞代偿性增生并伴有分泌过多,可进一步造成腹泻。

      根据研究推测,在形态学方面病毒颗粒由小肠吸收上皮细胞微绒毛间侵入胞浆,或由细胞吞饮作用将其卷入胞浆内,经溶酶体作用脱壳,进行核酸复制并合成病毒蛋白,病毒进入扩张的粗面内质网池之后获得其完全的衣壳。在实验感染后18~24h,上皮细胞广泛地感染病毒,胞浆电解质丢失,线粒体肿胀,微绒毛不规则,甚至感染上皮剥落,造成绒毛缩短。随后由肠腺隐窝增生的细胞加速向绒毛远端移行,取代肠绒毛脱落上皮,但这些细胞未能充分分化,呈低柱状,立方或扁平形被覆于绒毛上。绒毛的萎缩和被覆上皮分化差异导致电解质及营养物质吸收障碍,造成腹泻。严重的脱水及酸碱平衡失调可导致动物死亡。腹泻开始于感染早期,并持续数小时,一周或一周以上,幸存动物随着肠绒毛上皮的增生、分化,症状逐渐减缓。

      在病理生理方面:在绒毛萎缩的同时或稍早,腹泻开始出现。致病机制是多方面的,多数与小肠消化和吸收功能下降有关。腹泻的发生是因病毒导致小肠的消化功能与吸收功能降低,小肠内双糖酶(主要是乳糖酶)活性下降,导致双糖(主要为乳糖)在小肠肠腔内滞留,小肠内容物渗透压增高,引起渗透性腹泻。小肠内Na+/K+-ATP酶活性降低,葡萄糖二钠吸收减少,导致绒毛顶端对Na+的吸收减少,Na+和水分贮留在小肠肠腔,导致腹泻。

      腹泻还与病毒肠毒素NSP4有关,它能调节细胞 Ca2+的转运,引起细胞内 Ca2+浓度上升,C1-分泌增加而产生腹泻。NSP4致腹泻的方式与大肠杆菌不耐热肠毒素β相似,它刺激肠道分泌增加而不引起组织学上的改变。

      轮状病毒感染导致病猪死亡可能涉及多种因素,如腹泻引起脱水和电解质平衡紊乱,吸收不良引起营养不良、机体能量不足、体温下降等。腹泻的持续时间取决于修复的小肠绒毛上皮细胞的数量及修复所需的时间。在3日龄乳猪中,绒毛完全恢复到正常形态需要6~10d;在21日龄猪中,仅需2~4d。在幼小猪中恢复慢是由于绒毛萎缩严重和肠腺上皮细胞替换缓慢。另有些研究探讨轮状病毒和其他肠道病原混合感染的致病机理,发现先后接种A群轮状病毒与 K99鞭毛肠毒素性大肠杆菌、或溶血性肠毒素性大肠杆菌与轮状病毒或轮状病毒和TGEV等所引起的腹泻均比单独接种任何一种病原的腹泻程度严重。

      实验感染猪的死亡原因涉及几个相互联系的因素。腹泻造成脱水和电解质不平衡,可能导致细胞外液体储备的耗竭。吸收障碍导致营养障碍,可能导致能量不足和低体温。新生仔猪的高病死率很可能与更为严重和广泛的绒毛萎缩,细胞外液体耗竭和能量贮备的下降有关。低温易引起感染猪病死率的增高。用人A株轮状病毒接种新生仔猪,饲养于35℃环境下不引起死亡,如饲养于26℃则病死率可达70%~90%。病死率的差别归因于在较低温度条件下增加了能量的需求和诱发的营养障碍。病死率亦受病毒剂量的影响,据报道有2株猪A群病毒的最小感染量可小至1个空斑形成单位。在另一次试验中,90颗病毒粒子可使4日龄猪发生腹泻。用1株猪 A群病毒在不吃初乳的新生猪中作滴定试验,发现接种的稀释度越小(病毒剂量越大),试验猪的病死率越高。

五、病理变化

      病变主要限于消化道。胃迟缓,内充满凝乳块和乳汁。小肠肠管菲薄,半透明,肠内容物为浆液性或水样,灰黄色或灰黑色,小肠绒毛短缩扁平,肉眼也可看出,如用放大镜或解剖显微镜检查更清楚。小肠黏膜的这些变化,主要出现在空肠、回肠,是绒毛上皮细胞破坏和小肠适应性和再生性应答的综合。在腹泻开始的同时或稍早可以稍微看到一些肉眼可观的损害,在1~14日龄猪最为严重。胃内常存在食料,小肠1/2到2/3的肠壁较薄,内含大量水样、絮结的黄色或灰色液体而使肠管膨大。腹泻24h后,小肠蠕动增强而使胀大的肠管逐渐平复,肠管壁的厚度也渐恢复,外表接近正常。小肠后2/3部位的乳糜管中不含乳糜,相关的肠系膜淋巴结小而呈棕黄色。盲肠和结肠也含类似内容物而胀大。在21日龄以上的猪中,肉眼观察损害较轻。肠系膜淋巴结水肿,胆囊肿大。

      组织学变化:据文献资料报道实验接种乳猪引起的显微损害有很多。接种后16~18h绒毛尖端的上皮细胞和周围的绒毛发生变性。变性细胞肿胀,细胞浆稀少,核肿大,细胞边缘呈不规则的毛刷状。变性细胞常自邻近细胞或基质脱离。接种后16~24h坏死细胞导致明显的绒毛萎缩,接种后24~72h最为严重。萎缩绒毛的尖端可被减薄的近乎扁平的上皮细胞覆盖,在固有层中有不等量的细胞碎片。接种24~48h后可以看到邻近绒毛暴露的固有层接触而导致绒毛融合。接种48~72h后,肠腺上皮增生而导致肠腺明显加深。正常绒毛完全再生所需时间取决于猪的年龄。在许多实验接种中,用扫描电镜详细研究了感染的小肠黏膜的表面解剖特征。变性的绒毛上皮细胞溶解或脱落导致绒毛腐蚀性缩短。在几个小时内,腐蚀的绒毛尖端被连续的上皮细胞层覆盖,几乎没有留下肿大和变性的上皮细胞。

      电镜观察:发现轮状病毒感染主要局限在小肠绒毛的上皮细胞,所以组织学检查病变主要局限在绒毛部,绒毛顶端柱状上皮由于病毒感染、增殖,导致上皮细胞脱落或坏死溶解。绒毛变短,隐窝上皮未分化成熟就移向发病感染的绒毛顶部上皮的位置,所以在绒毛顶部常见未分化成熟的立方上皮所覆盖,固有层可见有淋巴细胞、单核细胞和多形核粒细胞浸润。

      另有报道对实验感染和自然感染猪进行超微结构的研究显示,病毒感染细胞的细胞浆中含有许多不同大小的电子致密的颗粒状包涵体,这种包涵体常有致密的亚病毒髓核或单衣壳颗粒,单衣壳颗粒通过粗糙型内质网的膜出芽获得外层衣壳。成熟的、直径78nm的双层衣壳病毒粒子积聚在内质网池内,当细胞溶解时释出胞外。病毒感染细胞的其他退行性病变,包括细胞肿大、线粒体肿大、核肿大、细胞腔网扩大、微绒毛断裂。在固有层巨噬细胞的吞噬泡中含有细胞膜轮廓、病毒粒子、病毒包涵体和其他细胞碎片。

六、诊断     
(一)临床综合诊断

      本病发生于寒冷季节,多侵害幼龄动物。突然发生水样腹泻,发病率高而病死率一般较低,主要病变一般在小肠,根据这些特点,可以作出初步诊断。但是,轮状病毒病要与猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和仔猪黄痢、白痢区别,因此进行实验室检查是必要的。     

(二)实验室诊断

      临床及病理学诊断一般难以确诊。因此,实验室诊断至为重要。

      1.病原学检查

      (1)电镜检查:是常用的诊断法。将粪便提取液经超速离心浓缩,沉淀物用磷钨酸负染直接观察。直接电镜法检查粪样中的病毒粒子时,要求粪样中含108 /mL病毒粒子才可获得阳性结果。因此,应收集发病初期的腹泻粪样,其含毒量较高,易于检出。

      (2)病毒分离:可用MA-104、CV-1、ST等传代细胞或猪、牛肾原代细胞等分离病毒。若粪便标本先用胰蛋白酶处理( 10~20teg/mL),可提高病毒的分离率。若仍不能适应细胞培养,则可将粪样抽提浓缩后感染剥夺初乳的同源动物1~2代,以提高适应细胞培养的成功率。

      (3)聚丙烯酰胺凝胶电泳法:是目前较常用的方法。利用轮状病毒基因组分为11个片段的特征,直接从待检粪样重提取病毒核酸,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE),硝酸银染色,观察其特征性图谱。此法尚可区分人和动物的轮状病毒。

      此外,反向间接血凝法、乳胶凝集试验、免疫荧光法等亦常应用。     随着分子生物学新方法的不断涌现,核酸探针杂交技术、PCR技术也可用于轮状病毒的检测。1998年刘明军等人建立了用光敏生物素标记核酸探针检测A群轮状病毒,用生物素标记寡核苷酸探针检测B群轮状病毒的研究方法。     2.血清学检查  目前较常用的是ELISA双抗体夹心法及反向间接血凝抑制(RIHI)试验,亦有报道用微量补体结合试验进行抗体检测的。ELISA双抗体夹心法,已被世界卫生组织(WHO)列为轮状病毒的标准检测方法。     为了鉴定粪样中轮状病毒亚群和血清型特异性,最近建立了一种快速、简便的应用特异性单克隆抗体( Mabs)的ELISA。Y.Pongsuwanne等( 1989)以此法调查了泰国人、牛、猪轮状病毒株的亚群和血清型分布,还用RNA构型分析和电镜技术对某些检样不能确定亚群或血清型的原因作了探讨。所有被检的牛和猪轮状病毒均显示亚群I特异性和长链RNA构型。值得注意的是,血清3型猪轮状病毒的检出率很高。     3.鉴别诊断应特别注意与猪传染性胃肠炎(TGE)、猪流行性腹泻(PED)相区别。通过对粪便标本的电镜检查及ELISA试验即可区别。侯继波等( 1995)报道,斑点免疫渗滤试验用于猪的3种病毒性腹泻的诊断及鉴别诊断,其特异性高于常规 ELISA。七、防制     本病无特效治疗药物。疫苗正在研制中,不久将用于生产。由于发病日龄多为1~lOd的仔猪。主动免疫很难在短时间内产生坚强的免疫力。因此,采用被动免疫是一个方向,免疫母猪,仔猪吃到初乳,产生被动免疫,新生仔猪口服抗血清,也能得到保护。     发现病猪,立即隔离到清洁、干燥和温暖的猪舍,加强护理,尽量减少应激因素,避免猪群密度过大,清除粪便及污染的垫草,消毒被污染的环境和器物。     治疗本病尚无特异的治疗方法。采取补液,内服肠道收敛剂、免疫球蛋白制剂,饲喂葡萄糖一甘氨酸的电解质流液等措施,以最大限度地减轻由轮状病毒感染引起的脱水和体重下降。抗生素可防止继发感染。     葡萄糖盐溶液给发病猪口服,效果良好。配方为氯化钠3.5%、碳酸氢钠2.5g、氯化钾1.5g、葡萄糖20g、常水l000mL混和溶解,每千克体重口服此液30~40mL,每日2次,同时,进行对症治疗,内服收敛剂,使用抗生素和磺胺药物,以防止继发感染。静脉注射5%葡萄糖盐水和5%碳酸氢钠溶液,可防止脱水和酸中毒。

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