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猪巨细胞病毒感染

      猪巨细胞病毒病是由猪细胞巨化病毒( Porcine eytomegalo virus PCMV,简称猪巨细胞病毒)引起的,主要发生在幼龄仔猪,以引起鼻炎为特征的一种仔猪常见传染病,又称猪包涵体鼻炎、猪巨细胞包涵体病、猪细胞巨化病毒感染症。在易感猪群中可引起胎儿和仔猪死亡、仔猪鼻炎、肺炎以及生长发育不良、增重缓慢等临床症状。

      本病在1955年英国首次报道,从鼻炎病猪的鼻甲黏膜腺细胞中发现巨大、嗜碱性核内包涵体,因此称为包涵体鼻炎。1972年日本也有本病的报道,目前广泛分布于世界各地。

一、病原

      猪巨细胞病毒( PCMV)又称猪疱疹病毒2型,最初由于本病常波及泪腺和唾液腺,把病原病毒称为唾液腺病毒,随后对其生物学特征作了详尽研究,将其归人疱疹病毒β亚科的巨细胞病毒属。近来有人认为将本病毒划在玫瑰疹病毒属中更为恰当。猪巨细胞病毒在形态上属于典型的疱疹病毒,猪巨细胞病毒中心为电子致密的类核体,直径45~70nm,衣壳呈二十面体,直径80~100nm,最外是囊膜,多数为一层,偶尔为双层,直径120~150nm。类核体常呈圆形,也有呈长方形或哑铃状。核衣壳与囊膜之间由半透明的晕圈隔开,囊膜外面有纤突。在体内和体外经常看到没有类核体或具有半透明类核体的病毒粒子,也看到没有囊膜的核衣壳。基因组为双链DNA。有关猪巨细胞病毒抗原特性的研究很少,迄今尚未发现有明显不同抗原性的毒株。猪巨细胞病毒不同地区分离株之间可能存在抗原结构的差异。本病毒的抗原特异性较强,与其他疱疹病毒尚未发现有交叉反应。

      猪巨细胞病毒在体外增殖有一定难度,用猪的肾或睾丸原代细胞、末梢血液中的巨噬细胞以及猪肾细胞系培养,均不能增殖,但直接用已感染了病毒的猪肾或睾丸,作细胞带毒培养,病毒则可充分增殖,并出现细胞病变。在原代细胞中只有3~5周龄仔猪的肺泡巨噬细胞最适宜于病毒的首次分离和连续传代。猪巨细胞病毒在猪肺泡巨噬细胞培养物上增殖很慢,接种后3~14d才可看到巨细胞形成和核内包涵体,偶尔还可见细胞浆内包涵体,但其大小比核内包涵体要小。在接种11~14d后,猪巨细胞病毒的最高滴度可达5.5TCID50/mL。然而,肺泡巨噬细胞自身不能繁殖,因此,必须用原代细胞培养物进行病毒的传代。由于肺泡巨噬细胞经常受到包括猪巨细胞病毒和猪繁殖与呼吸道综合征病毒在内的病毒污染,故在细胞使用之前要对这些病毒进行监测,确保安全可靠、无污染。较可靠的办法是使用无菌猪或SPF猪肺泡巨噬细胞。据Kawamura H等报道,猪输卵管细胞可支持该病毒复制,Bouillant等也报道了输卵管类上皮和输卵管类成纤维细胞可以用于病毒培养,但其细胞病变不明显,必须用姬姆萨染色或标记抗体染色后才能观察。另有报道,十四烷酰佛波醇乙酸酯能增强病毒的复制。该病毒在56℃经30min灭活,22℃只能保持24h活性。但将患病仔猪鼻黏膜组织保存于-30℃,其感染力至少可维持5个月,病毒液在-60℃下可保存2年以上。猪巨细胞病毒对有机溶剂(如氯仿和乙醚)敏感,经过这些试剂处理,可使其丧失感染力。

      PCMV可以适应原代猪肺细胞,也有人认为只能在3-5周龄猪的肺巨噬细胞培养中作病毒分离和传代。接毒后3~14d出现巨细胞,形成核内包涵体和偶而有小的胞浆内包涵体。感染细胞增大到正常细胞的6倍左右。线粒体、内质网和高尔基体肿胀,可看到大的嗜碱性核内包涵体。

      在细胞培养中,感染的肺巨噬细胞用丙酮固定后以间接免疫荧光(IIF)检测,细胞核、核膜显示明亮的荧光。猪血清中PCMV的滴度常达1:64~1:128。此法比病毒中和试验至少敏感8倍。ELISA也比中和试验敏感,并能区分IgG和IgM的免疫应答。

      据电镜观察,病毒的性质及其所致病变与人的细胞巨化病毒和豚鼠的唾液腺病毒类似,而本病毒感染动物的范围仅限于猪,故又将该病毒称为猪巨细胞病毒( PCMV)。

二、流行病学

      1.易感性   PCMV分布于全世界,英国和日本的血清学调查表明90%以上的猪群被感染,用ELISA和间接免疫荧光检查,98%以上的猪为血清学阳性猪。PCMV在体内和体外对宿主的选择有特异性,它不能感染兔、小鼠、仓鼠、鸡胚和牛。

      2.传染源    3~8周龄小猪从鼻排出的病毒最多,推测在初生时或先天性感染。在这一阶段抗体滴度下降,到8~11周龄时抗体水平再度升高,直到23周龄宰杀。这种现象推测仔猪出生后母源抗体逐渐被主动免疫所替代。实验性感染证实木乃伊胎、死产、新生乳猪死亡和鼻炎或肺炎所致发育不良猪的出现与此病有关。当猪使用皮质类固醇等药物后,排毒再度开始,可能此药激活了病毒的增殖,新繁殖猪群的进入或猪群受到扰乱时也会激活病毒的增殖。

      3.传播途径    最常见的传播途径是呼吸道。被尿污染的环境也不容忽视,病毒自口鼻分泌液、尿、怀孕母猪的子宫颈流出液中排出,也能自公猪睾丸和副睾分离病毒。本病也可通过胎盘造成垂直感染。

      4.发现历史与流行现状    本病于1955年在英国最早报道。Done (1955)在英格兰从猪鼻甲骨黏膜黏液腺中分离获得疱疹样病毒粒子。因患病猪临床上以鼻炎为特征,并在感染的鼻甲骨黏膜黏液腺巨细胞中可见到大量嗜碱性核内包涵体,因而将猪巨细胞病毒引起的这种疾病称为包涵体鼻炎。

      目前本病毒广泛分布于世界各地。从近年的报道看,常规条件下饲养的大多数猪群均存在猪巨细胞病毒感染,猪巨细胞病毒抗体阳性率都很高,但大多数为亚临床型,临床发病很少见。欧洲很多国家都发现有本病存在。德国用PCR方法调查猪的流行率要高于50%,在英国血清学检查结果表明,90%以上的猪群曾受到过感染,通过ELISA或IFA检测,发现98%以上的猪血清呈阳性。在日本自1972年就有本病病理学方面的报道,1981年对441例肥育猪血清用ELISA和IFA所作的抗体检测的阳性率分别为99.4%和98.4%。北美和澳大利亚也有本病报道,其中美国发病率甚高,猪群的抗体保有率为90%。我国对本病尚未见详细报道。

三、发病机理

      人工发病试验,怀孕母猪在接种病毒后14~21d表现为倦怠、厌食,这与病毒血症期一致。不久即可以从鼻液拭子中分离到病毒。在接种30~35d时可从子宫颈洗液中分离出猪巨细胞病毒,对生长阻滞的放射照相分析表明:绝大多数的死胎发生于这一时期,这说明病毒又经过14~20d在胎儿进一步复制,同时说明子宫排毒是胎源性的而非母源性的。在此阶段的子宫颈和子宫内膜中均未查到病毒和包涵体。在少数猪胎儿中,病毒在接种后60~80d方可检测到,但还不清楚这是子宫内接触感染,还是病毒在胎儿中迟发性复制,或是病毒偶然的穿过了胎盘。受检的少数先天性感染动物持续排毒,在出生后7d内伴发全身性感染的组织学病变而突然死亡。与有低水平循环抗体的母猪的二重感染与胎盘感染有关。胚胎植入后短时间内即被感染,引起胚胎死亡,这种病毒经常存在于早期胎儿的脑膜、枯否氏细胞和腹膜巨噬细胞内。鼻内实验性感染青年猪在病毒血症前,从鼻腔及结膜拭子中有时可分离到病毒,这提示病毒复制的最初部位是在鼻黏膜腺、泪腺或副泪腺。经鼻腔接种病毒的3周龄猪在感染后14~16d可见到病毒血症,在新生猪中病毒血症的出现在感染后5~19d,血液的感染性与白细胞有关,以后可从鼻腔分泌物中分离到病毒的时间长达32d,咽和结膜的排毒时间较短,而病毒尿症的持续排毒时间难以确定。

      大多数3周龄或3周龄以上的动物被感染时,病毒扩散到上皮,尤其是鼻黏膜腺、泪腺、副泪腺和肾小管,附睾和食管的黏膜则较少,病毒还扩散到肝细胞和十二指肠上皮。在胚胎或新生猪,病毒比较容易侵入嗜网状内皮细胞,尤其是毛细血管内皮和淋巴样组织的窦状腺,进而引起全身性损伤。当病毒在网状内皮和上皮细胞中复制时,在两组细胞中均可产生包涵体。虽然在附睾中偶尔可见到包涵体,但一直未从精液中分离到病毒。包皮接种也未能造成感染,然而公猪可在尿和鼻分泌物中排出病毒。

四、症状

      潜伏期为14~21d。人工发病试验和自然感染猪巨细胞病毒均可引起相同症状。

      妊娠母猪感染后在整个妊娠期未见有发热或其他临床异常,但在病毒血症阶段常常会嗜眠、食欲不振,如首次感染发生于妊娠后期的母猪,则引起产死胎、木乃伊胎、死产和不育等繁殖障碍。有些仔猪出生后可能未见有临床症状即死亡,有些弱仔表现为贫血、皮肤或勃膜苍白、不同程度的水肿、生长及发育不良。

      本病常发生于1~3周龄的仔猪,发病程度与初乳中获得母源性抗体多少有关。5~10日龄仔猪感染后,呈现急性经过,其主要症状是呼吸道症状,如打喷嚏、咳嗽、流泪、鼻分泌物增多,继之出现鼻塞、吮乳困难,体重很快减轻。如果无母源抗体的仔猪感染,则可能发生鼻蛆。严重时还可见仔猪颤抖和呼吸困难等症状,可在发病后5d死亡,一窝仔猪中死淘率可高达25%,其他耐过的仔猪表现生长、发育不良,增重变慢。少数病例发生鼻甲骨的萎缩和颜面变形,据称可能与混合感染有关。据野外长期观察发现,猪巨细胞病毒和支气管败血波氏杆菌之间有协同感染作用。

      一些3周龄以内的猪只表现轻度的呼吸道感染的症状,病理检查时有上皮感染的广泛性损害,其发病率与死亡率都很低。若无并发或继发其他感染,3周龄以上的猪感染猪巨细胞病毒后通常不表现出临床症状。但有些初次感染猪巨细胞病毒的成年猪可能与妊娠母猪相似,体温并不升高,但在病毒血症阶段会出现嗜眠、食欲不振,并产生全身性感染的损害。3月龄以上的猪感染,无明显的症状。康复猪常成为隐性感染,长期排毒,是危险的传染源。

五、病理变化

      病猪的主要病变在上呼吸道,鼻黏膜表面附有卡他性脓性分泌物,深部黏膜因细胞聚集而形成灰白色小病灶。3月龄内感染的仔猪表现广泛的小点出血和水肿。心包和胸膜积水,鼻黏膜大量小的坏死灶、水肿、出血。颌下、耳下淋巴结肿胀,有出血点。肺间质水肿,尖叶和心叶有炎性病灶,肺叶的腹侧端呈紫色实变。喉和跗关节的周围皮下明显水肿。仔猪和胎儿的全身感染可见广泛性出血和水肿。胎猪感染后无特定的肉眼病变,表现繁殖障碍的特征,即死产、木乃伊胎,胚胎死亡和不育。全身淋巴结肿大并有瘀点。偶尔在小肠也可见出血,病变从短于lcm的区域至全肠段不等。

      组织学检查,在鼻黏膜腺、副泪腺和泪腺的腺泡和泪管上皮和肾小管上皮中可看到特征性的嗜碱性核内包涵体和巨大细胞。在感染的上皮组织周围,积聚着淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞。鼻黏膜上皮细胞纤毛缺损,变性、脱落,遗留的腺泡形成局灶性淋巴组织增生。间质性肾炎。中枢神经系统存在稀少的局灶性神经胶质细胞增生,在胶质细胞中有时看到包涵体。

      病理组织学观察,较大猪上皮组织的广泛性感染与胎儿或新生仔猪的网状内皮组织全身性感染是不同的。在较大猪的鼻黏膜腺、副泪腺及泪腺的腺泡和导管上皮、肾小管上皮中,可见到特征性的嗜碱性核内包涵体及巨细胞。在食管的黏膜腺、附睾管、输精管、十二指肠和空肠黏膜的上皮细胞中也可见到少量的包涵体。在这些病变部位,淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞积聚于感染的上皮组织周围,并侵入腺泡。在腺泡损伤处,由导管增生的鳞状上皮取代,在鼻甲骨豁膜中有局灶性淋巴组织增生。肾表现为间质性肾炎的病变。在中枢神经系统可见到稀少的局灶性胶质细胞增生,有时在胶质细胞中可看到包涵体。在引起胎儿感染的急性致死性综合征中,包涵体多见于毛细血管内皮细胞和窦状隙细胞中,故在所有淋巴和实质组织中均可发现包涵体。上皮损伤造成局部水肿、出血,巨噬细胞和红细胞渗出到扩张的细胞外间隙中。在血管和脾脏可见到含有包涵体的单核细胞,肺泡组织中则以感染的巨噬细胞为主。在肝细胞内的病毒复制造成肝脏局灶性坏死。在肾脏,包涵体多见于分化的肾组织和肾小球毛细血管内皮。出血和胶质细胞增生遍及整个中枢神经系统,尤其是在脉络丛、小脑和嗅叶。野外暴发时,由于并发感染而使病变更为复杂化。据报道,这些并发感染有黏液性化脓性鼻炎、肺炎和肠炎等。

六、诊断

      母猪显示SMEDI状繁殖障碍时,必须与猪细小病病毒和伪狂犬病相区分。可从新生乳猪或胎猪采集鼻黏膜、肺和肾样品作病毒分离,或直接取肺巨噬细胞作培养。如病猪尸体保存在4℃,可将组织做成冰冻切片后用免疫荧光检查,即使组织丧失感染力后24h仍能检出PCMV0此外特征性的核内包涵体和巨细胞是具有诊断意义的组织学变化。如怀疑猪群的传染性鼻炎中同时存在PCMV,可取鼻拭子作病毒分离,或刮取鼻黏膜作免疫荧光检查。

      1.病毒分离与鉴定     可采集胎儿或新生仔猪的鼻汁或鼻腔、喉头、结膜等拭子以及肺、肾、淋巴结等材料,接种肺泡巨噬细胞或输卵管类成纤维细胞,进行病毒分离,也可以用肺泡巨噬细胞直接培养分离病毒。接种病料后培养7~14d,观察细胞病变。用荧光抗体染色检查细胞核内包涵体出现情况,或检查细胞浆内的荧光抗原。如用已知标准毒株的免疫血清,以标准的病毒培养物为对照,对分离毒株进行中和试验,可对病毒分离物予以鉴定。病毒的形态观察和理化学特性检查,也有一定的参考价值。电镜检查在感染的细胞核和细胞浆内(主要为空泡内)能发现结晶状排列的病毒。

      2.组织病理学的包涵体检查   对于全身感染的病猪,可采取鼻黏膜或其刮削物作组织染色标本检查,根据在鼻黏膜管状腺见到特征性成丛的膨大细胞及嗜碱性核内“鹰眼形”包涵体,不难作出诊断。也可根据组织切片中的嗜碱性核内包涵体和巨细胞作出诊断,或作冰冻切片,用免疫染色法检测病毒抗原,继而作出诊断。在急性感染的幼龄仔猪肾和脑等组织,也可见到这种包涵体。

      3.血清学检测     血清抗体检测是确证猪群中存在猪巨细胞病毒最可信的方法,本法也可以用于对剖腹产猪进行监测。对育肥猪随机采集血清样品,用IIF或ELISA检测PCMV抗体,很易确诊。对育肥猪随机采取血清样品做间接免疫荧光试验( IFA)或者ELISA测定,将感染病毒的肺泡巨噬细胞或类成纤维细胞用丙酮固定,然后进行间接荧光抗体染色法检查,其试验敏感性比病毒中和试验至少高8倍,而且还可对不同类别的IgG和IgM抗体予以鉴别。人工感染后3周可检出抗体,6周后达最高值并一直持续到屠宰。现场猪的抗体效价多为64~128倍。也可应用感染的输卵管类上皮细胞作ELISA,它与间接免疫荧光抗体试验具有相同的敏感性。现场猪在2~3周龄感染病毒,血清抗体在5~6周龄转阳,并呈终生持续感染。Tajima等(1994)以血纸法建立了ELISA法,并将全血检查法与血清检查法的抗体效价进行了比较,样品的吸收值高度相关,对26份田间收集血纸的检查,发现这些仔猪出生后8周母源抗体水平下降,并从4头猪中检出IgM抗体。

      4.分子生物学检测     Hamel等(1999)首次报道了应用PCR诊断本病,采用直接从具有不同临床综合征的病猪肺和鼻黏膜的刮削物中提取DNA检查的方法,在126份样品中检出59份阳性样品,该方法有可能成为猪巨细胞病毒检查和监测的常规方法。之后,Fryer等( 2001)用定量竞争PCR对不同的猪器官(包括用于异种移植供体)进行了病毒的检测,可以从每微克DNA中检出低于10至97个基因组拷贝。

      5.鉴别诊断     呈现传染性鼻炎症状的仔猪,特别是1~3周龄患鼻炎的病猪,要考虑到发生本病的可能性。猪巨细胞病毒感染症易与伪狂犬病、猪腺病毒感染、猪细小病毒感染、日本乙型脑炎等相混淆,其鉴别依据在于猪巨细胞病毒感染症在某些上皮细胞内形成巨大的嗜碱性核内包涵体,不引起母猪流产。

      近年来猪呼吸繁殖综合征比较普遍,猪肺巨噬细胞常用以分离PRRSV,有时能发现PCMV。

七、防制

      在PCMV流行的猪群中,若有良好的饲养管理条件,本病影响不会很大。但当引入新猪群时,因为在循环抗体存在的条件下的激发潜伏感染,或在易感猪群中引起的原发性感染,对猪场有很大威胁。目前尚未有有效的疫苗可以预防本病发生。康复猪血清中虽产生相当水平的中和抗体,但不能清除体内的病毒,表明本病的免疫力不强。患病母猪的初乳内含有中和抗体,可为哺乳仔猪提供一定的保护力。但是在猪巨细胞病毒呈地方性流行的猪场,似乎只有存在循环的母源抗体时才向夕卜排毒。

      目前对此病也无有效的治疗方法,但在发生鼻炎时,可使用抗菌类药物控制细菌的继发感染。加强兽医卫生管理和改善饲养条件等综合措施,常可起到良好的预防作用。在猪群饲养管理良好时,在有猪巨细胞病毒引起传染性鼻炎或肠道病毒引起的死产(S)-木乃伊胎(M)-胚胎死亡(ED) -不育(I)综合征( SMEDI)的地方,疾病的暴发通常具有自限性。在猪巨细胞病毒呈地方性流行的猪群中,引种前要进行隔离和免疫检测,防止将传染源引入易感猪群中,导致本病暴发或激发原有猪群的潜伏感染。要建立无PCMV猪群可采用剖腹产,然而病毒可通过胎盘感染,所以要加强仔猪的抗体监测,建立阴性猪群,一般至少70天时仍为阴性才算安全。

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